Avaliar a eventual associação do polimorfismo C825T da Proteína G (GNβ3, rs5443) com o aparecimento de HTA, numa população portuguesa do Arquipélago da Madeira.

Este estudo foi aprovado pela Comissão de Ética do Sesaram (Serviço de Saúde da Região Autónoma da Madeira) e foi conduzido de acordo com as diretrizes éticas internacionais da Declaração de Helsínquia de 2013.

Todos os indivíduos assinaram o termo de consentimento informado e foram informados, pelo médico internista com mais de 10 anos de experiência, acerca da colheita de sangue para análise e armazenamento e reutilização de ADN e de dados clínicos relevantes. As amostras de sangue para fins genéticos são mantidas no nosso biobanco de pesquisa hospitalar de acordo com os artigos 6, 15 e 16da Declaração Universal da Unesco sobre Bioética e Direitos Humanos.

Este estudo foi feito no Arquipélago da Madeira, Portugal, cuja população é de cerca de 300 000 habitantes. Os indivíduos participantes no estudo são de etnia branca, naturais do Arquipélago da Madeira, e os seus progenitores (1.ª e 2.ª geração) são também nascidos nesse arquipélago e da mesma etnia. Procuramos dessa forma que essa população de indivíduos fosse geneticamente homogénea e representasse assim uma população da Europa do Sul.

Com uma amostra de 1641 indivíduos com média 50,6 ± 8,1 anos, 848 (49,9%) eram do género masculino, selecionados sequencialmente das consultas de medicina geral e familiar e de medicina interna do Hospital Central do Funchal.

Constituímos dois grupos, com a nossa amostra, consoante tinham ou não HTA, procuramos que não houvesse diferenças significativas entre ambos os grupos em termos de sexo e idade.

A HTA foi considerada se os indivíduos à entrada no estudo já estivessem diagnosticados e/ou cumprissem medicação anti‐hipertensiva havia mais de três meses ou ainda se fossem hipertensos recém‐diagnosticados com pressão arterial sistólica (PAS) e/ou pressão arterial diastólica (PAD) ≥ 140/90mmHg, avaliada em, pelo menos, três ocasiões27.

Foram excluídos todos os indivíduos com hipertensão secundária, tais como hiperaldosteronismo primário ou doença renal clinicamente relevante, e os que receberam medicação para outras indicações que pode afetar a pressão arterial.

Os controlos normotensos nunca tinham feito medicação anti‐hipertensiva e apresentavam PAS/ PAD < 140/90mmHg.

Foi avaliada a pressão arterial a todos os indivíduos, após 10min de repouso, em posição sentada, no braço direito, com o uso de um esfigmomanómetro Welch Allyn padrão (fases I a V), e foi registada a média de três leituras feitas com intervalo de dois min27.

Todos os participantes responderam a um questionário padronizado em relação a idade, sexo, estilo de vida, tabagismo, consumo de álcool, história pessoal e familiar de eventos cardiovasculares, nomeadamente acidente vascular cerebral e doença das artérias coronárias e história familiar de HTA.

Foram avaliados, em todos os participantes, os parâmetros antropométricos. Foi medida a altura em centímetros e o peso em quilogramas e calculado o Índice de Massa Corporal (IMC) com o uso da fórmula (kg / m2)28. O IMC foi dividido em três subgrupos: normal (< 25kg/m2), excesso de peso (25 ≤ IMC < 30kg/m2) e obesidade (IMC ≥ 30kg/m2)28. O perímetro abdominal foi avaliado e considerado elevado quando superior a 94cm para o sexo masculino e a 80cm para o feminino29. A razão cintura/anca foi calculada, foi considerada elevada para um valor > 0,9 para o sexo masculino e > 0,8 para o feminino29.

A velocidade de onda de pulso (VOP) foi determinada por tonometria através do Complior como previamente descrito30. Um valor de VOP > 10 m/s2 foi considerado elevado. A diabetes mellitus (DM) foi definida por um nível de glicose em jejum ≥126mg/dl e/ou um nível de glicose ≥ 200mg/dl e/ou uma história de tratamento para DM31.

Sedentarismo foi definido quando os indivíduos não praticavam pelo menos 150 minutos/semana de atividade física moderada a vigorosa29.

Consideraram‐se fumadores aqueles que à data da entrada no estudo tinham hábitos tabágicos e dividiu‐se essa variável em três subgrupos, consoante o número de cigarros consumidos por dia: de um a 10 cigarros; entre 10 a 20 cigarros e mais de 20 cigarros. Os indivíduos que ingeriam álcool à entrada do estudo foram considerados como tendo hábitos alcoólicos. Quantificou‐se o consumo de álcool em gramas por semana, foi considerado excesso quando superior a 70 gr/semana no sexo masculino e 50 gr/semana no feminino.

As amostras de sangue foram extraídas após 14‐16 horas de jejum e o plasma foi preparado para a quantificação dos perfis biológicos. As análises bioquímicas foram feitas no Laboratório Central do Hospital, de acordo com as técnicas usuais.

Para determinar o colesterol total, HDL, LDL, triglicéridos e glucose, as amostras de sangue foram colocadas em tubos secos, centrifugadas durante meia hora a 3500g e posteriormente quantificadas por uma técnica enzimática com o uso de um analisador automático «AU 5400» (Beckman Coulter). Os marcadores bioquímicos de risco lipoproteína (a), apoliproteína B e a Proteína C‐reativa de alta sensibilidade (PCR‐as) foram quantificados por um aparelho automático «AU 5400» (Beckman Coulter) pela técnica de imunoturbidimetria. Em relação ao fibrinogénio, a colheita também foi feita com o doente em jejum, para um tubo com citrato de sódio, com o uso de um analisador automático «ACL TOP 700».

O ADN genómico foi extraído dos leucócitos do sangue periférico com o uso do método de salting‐out. A análise genotípica foi efetuada com sondas oligonucleotídicas marcadas com fluorescência específica para cada um dos alelos num ensaio que combina a técnica convencionada de PCR e a técnica TaqMan (Applied Biosystems). Os primers e as sondas foram as pré‐estabelecidas pelo fornecedor (TaqMan SNP Genotyping Assays, Applied Biosystems) para o polimorfismo C825T do gene GNβ3 (rs5443), os oligonucleótidos foram sintetizados e os marcadores fluorogénicos FAM e VIC acoplados às extremidades 5’ das sondas de modo a alcançar a discriminação alélica. A reação de polimerização em dois passos consistia em 40 ciclos de desnaturação a 92°C durante 15 segundos e de primer annealing e extensão a 60°C durante um minuto e foi efetuada num aparelho 7.300 Real‐Time PCR System (Applied Biosystems). Os genótipos foram determinados com o 7.300 System SDS Software (Applied Biosystems) sem qualquer conhecimento prévio dos dados clínicos individuais (Fig. 1).

Figura 1.

Discriminação genotípica do polimorfismo C825T do gene GNβ3 no Aparelho 7300 Real‐Time PCR System (Applied Biosystems).

(0.19MB).

As variáveis categóricas são apresentadas pela frequência e a sua respetiva percentagem, com o uso do teste de qui‐quadrado. As variáveis contínuas são expressas com a média ± desvio padrão ou mediana (mínimo–máximo). Para comparar as variáveis contínuas foram usados os testes t de Student ou o teste não paramétrico de Mann‐Whitney, conforme apropriado.

O equilíbrio de Hardy‐Weinberg foi calculado para cada um dos genes com o uso do teste de qui‐quadrado. Um valor de p inferior a 5% foi considerado estatisticamente significativo, enquanto o valor Pb (p dividido pelo número total de comparações) foi considerado após a correção de Bonferroni.

Para determinar, por análise multivariada, quais as variáveis associadas ao aparecimento de HTA, foi elaborada uma regressão logística com o uso do método Forward Wald.

A força de associação foi determinada pela odds ratio (OR) e pelos respetivos intervalos de confiança (IC) a 95%.

Os dados estatísticos foram analisados com o uso do software estatístico SPSS (Statistical Package for the Social Sciences) versão 19.0. Usamos como limiar de significância o valor de p < 0,05.

Apresentamos as características basais dos participantes do estudo na Tabela 1. A população estudada é composta por 1641 indivíduos, 848 casos com HTA (idade média de 50,8 ± 8,1; 51,8% do sexo masculino) e 793 controlos sem HTA (idade média de 50,3 ± 8,2; 47,9% do sexo masculino). As variáveis género e idade foram ajustadas entre os grupos, não houve diferenças significativas (Tabela 1).

Verifica‐se que houve diferença significativa em relação às seguintes variáveis: consumo de álcool (p = 0,008), IMC e obesidade (p < 0,0001), perímetro abdominal (p < 0,0001) e cintura/anca (p < 0,0001), apresentaram valores médios mais elevados no grupo dos hipertensos em relação aos controlos. Da mesma maneira, a DM, dislipidémia, pressão arterial sistólica e distólica, frequência cardíaca e a VOP foram mais frequentes no grupo dos indivíduos hipertensos em relação aos normotensos, com significância estatística (p < 0,0001). No grupo dos hipertensos, havia mais indivíduos com história pessoal (p = 0,002) e familiar (p < 0,0001) de eventos cardiovasculares, assim como história familiar de HTA (p < 0,0001). Constatou‐se também que havia uma maior percentagem de fumadores no grupo dos controlos em todos os subgrupos, exceto nos que fumavam mais de 20 cigarros/dia, em relação ao grupo dos hipertensos e com significância estatística (p < 0,0001).

Em relação às variáveis bioquímicas (Tabela 2), houve diferença significativa entre os dois grupos em relação à hemoglobina (p < 0,0001), leucócitos (p < 0,0001), fibrinogénio (p < 0,0001), HDL‐colesterol (p < 0,0001), triglicerídeos (p < 0,0001), apolipoproteína B (p < 0,0001), glicose em jejum (p < 0,0001) e PCR (as) (p < 0,0001), que também apresentaram valores médios mais elevados no grupo dos hipertensos em relação aos controlos. Em relação às variáveis colesterol total, LDL‐ colesterol, lipoproteína (a) e plaquetas não houve diferença significativa entre os dois grupos (p > 0,05).

Apresentamos as frequências dos alelos do polimorfismo genético C825T do gene GNβ3 na Tabela 3. A frequência dos alelos C e T do polimorfismo C825T na população total da nossa amostra foi de 60,5% e de 39,5%, respetivamente. No grupo dos casos e controlos seguiu a mesma tendência, atingiu um valor de OR de 1,106, mas sem significância estatística (p = 0,158) (Tabela 3).

A frequência de cada genótipo em ambos os grupos, casos e controlos, foi encontrada em conformidade com o equilíbrio de Hardy‐Weinberg (Tabela 4). O genótipo mais frequente, no modelo aditivo, foi o heterozigoto CT, que apresentou valores de 50,7% e 44,3% nos casos e controlos, respetivamente, quando comparado com o genótipo homozigoto de referência CC. Esse genótipo acarretou um risco maior de 1,336 (p = 0,008) em relação ao homozigoto mutado (OR = 1,107; p = 0,494) (tabela 4).

No modelo dominante (Tabela 5), os indivíduos com genótipo (CT ou TT) tinham um maior risco de desenvolver HTA (OR = 1,275; IC 95% = 1,042–1,559) quando comparados com o genótipo de referência (CC) (p = 0,018).

Foi feita uma análise de regressão logística (Tabela 6), as variáveis que permaneceram na equação foram: DM, obesidade, consumo de álcool e os genótipos CT e TT do polimorfismo GNβ3, associaram‐se de forma significativa e independente ao aparecimento de HTA (Tabela 6).

Os hábitos tabágicos surgem na equação como variável protetora em relação ao aparecimento de HTA. O sedentarismo saiu da equação, não influenciou o aparecimento de HTA (Tabela 6).

O presente estudo é o primeiro estudo caso‐controlo feito na população da Ilha da Madeira, uma população portuguesa geneticamente homogénea45–47 e relativamente isolada, em que se investiga a associação do polimorfismo GNβ3 C825T com a suscetibilidade para a HTA.

Essa população, com as características citadas, representa uma mais‐valia para o mapeamento de distúrbios raros e, além disso, segundo vários pesquisadores, o estudo de populações culturalmente e geneticamente isoladas que apresentam um modo de vida, hábitos alimentares e ambiente natural idênticos pode reduzir a variação ambiental48.