Foram utilizados coelhos New-Zealand brancos de ambos os sexos (n=17, 3,0-4,9kg), anestesiados com pentobarbital sódico (60mg/kg, i.v.). Através duma traqueostomia foi colocada uma cânula abaixo da laringe para ventilação intermitente com pressão positiva e mistura de ar com O2 (modelo 607, Harvard Apparatus, Reino Unido; 60 ciclos/min) após bloqueio neuromuscular (vecuronium 0,05mg/kg/h, i.v.), para assegurar o controlo da frequência e do volume respiratórios. O grau de anestesia foi avaliado com base na monitorização da pressão arterial (PA), frequência cardíaca (FC) e atividade respiratória, utilizando-se doses suplementares dos fármacos para manter um efeito estável da anestesia geral. A artéria femural foi canalizada para monitorização contínua da PA (transdutor SensoNor 840) e a veia femural usada para administração de solução salina a 0,9% e fármacos. A bexiga foi cateterizada e drenada. A temperatura retal foi mantida a ∼38°C com recurso a uma placa de aquecimento colocada debaixo do animal (Harvard Apparatus, Reino Unido). O registo de ECG obteve-se com elétrodos bipolares subcutâneos colocados nos quatro membros, com amplificação e filtragem do sinal. O ECG, a PA e os eletrogramas foram continuamente monitorizados num polígrafo (Lectromed, Hertfordshire, Reino Unido) e analisados em computador (PowerLab, ADInstruments).

O animal anestesiado era colocado em decúbito ventral para exposição da porção dorsal do tórax, procedendo-se a uma incisão ao nível das vértebras C6-T2, utilizando eletrocautério e um afastador automático para acesso à vértebra T1, submetida a perfuração com broca de 2mm até abertura da dura mater espinhal. Após posicionamento em decúbito dorsal, identificava-se o nervo vago cervical direito através de incisão na linha mediana do pescoço, seguindo-se o seu isolamento e preparação para estimulação elétrica bipolar com elétrodos de platina, com isolamento por parafina semissólida. Uma ligeira rotação permitia inserir um elétrodo bipolar através do canal espinhal com recurso a micromanipulador (WPI, M330), para estimulação do fluxo simpático torácico ao nível de T1, que inclui sobretudo fibras pré-ganglionares para o gânglio estrelado21. Os elétrodos para estimulação do nervo vago e tronco simpático foram conectados a um estimulador programável de múltiplos canais (Master8, AMPI, Israel). O nervo vago foi estimulado (20Hz, duração do impulso - 2ms), com a amplitude ajustada para induzir uma diminuição da FC de ≈50%, e a estimulação simpática (3Hz, duração do impulso - 1ms) testada para obter um aumento da FC e da PA.

Além da monitorização da FC e PA, registámos séries de 30 segundos de intervalos RR para análise espectral com Transformada de Fourier (Fast Fourier Transform), com recurso a software MatLab (MathWorks, Natick, MA, EUA) em ambiente Origin (OriginLab, Origin Lab Corporation, Northampton, MA, EUA), para confirmação da estimulação autonómica, de acordo com descrição prévia22,23. A frequência espectral foi dividida em três componentes: VLF (very low- frequency; 0,01-0,1Hz), LF (low-frequency; 0,1-0,3Hz) e HF (high-frequency; 0,3-1Hz). Os valores da banda HF foram atribuídos à modulação vagal e os da banda LF consideraram-se como refletindo a atividade simpática.

Procedemos a esternotomia mediana e abertura do pericárdio para exposição do coração e abordagem eletrofisiológica epicárdica das aurículas e VP. Depois da toracotomia, manteve-se uma pressão final expiratória de 1-2cmH2O.

As experiências foram efetuadas em conformidade com as recomendações do «Guide for the Care and Use of Laboratory Animals», publicado pelo National Institute of Health, e mediante aprovação pela Comissão de Ética da Faculdade de Medicina de Lisboa.

Os eletrogramas foram registados com quatro elétrodos monopolares (125-μm Ag-AgCl, isolados com Teflon), colocados numa rede de nylon com espaçamento interelétrodos de 4mm e aplicados em posição epicárdica, da aurícula direita lateral-alta (AD) à aurícula esquerda lateral-alta (AE) (Figura 1). Um elétrodo de ponta circular (cabo coaxial) foi posicionado envolvendo o segmento proximal das VP esquerdas para estimulação e registo de eletrogramas. Os eletrogramas foram amplificados e filtrados de 0,5 a 300Hz e de 30 a 250Hz para registos monopolares e bipolares, respetivamente (Neurolog, Digitemer, Reino Unido). No final do procedimento os animais foram sacrificados com uma overdose de anestésico.

Figura 1.

Preparação de tórax-aberto do coração de coelho com rede de nylon suportando elétrodos monopolares epicárdicos da aurícula direita lateral-alta até à aurícula esquerda lateral-alta. As setas indicam dois elétrodos com contacto epicárdico na aurícula esquerda. AAD=apêndice auricular direito.

(0.27MB).

A ativação epicárdica foi registada em ritmo sinusal, com análise dos tempos de condução interauricular (entre a AD e a AE) e da AD até à despolarização das VP, em condições basais e durante estimulação vagal, simpática ou simpático-vagal simultânea. A estimulação para estudo dos PRE e indução de FA foi efetuada com elétrodo bipolar (0,1mm, prata com isolamento de teflon) posicionado com micromanipulador (WPI, M330) no apêndice auricular direito (AAD) e apêndice auricular esquerdo (AAE), e com elétrodo circular nas VP. Em condições estáveis, procedeu-se a protocolo de estimulação programada (programador Master8, AMPI, Israel), com um extraestímulo durante pacing bipolar contínuo com ciclo de 300ms (ou 20ms inferior ao intervalo RR para FC >200 bpm). Utilizámos impulsos com duração de 1ms e o dobro da intensidade do limiar de captura. O extraestímulo foi introduzido com intervalo de acoplamento 100ms inferior ao do ciclo de base, diminuindo-se depois em intervalos de 5ms até atingir o PRE. O PRE foi definido como o intervalo S1-S2 mais longo com falha de despolarização local. Os intervalos de condução e os PRE foram analisados em condições basais e durante estimulação vagal, simpática ou combinada. Para avaliação da vulnerabilidade para indução de FA foi utilizado pacing de alta-frequência (50Hz, 10s, intensidade supralimiar), com elétrodo bipolar posicionado no AAD, AAE e VP, isolado ou combinado com estimulação vagal, simpática ou simpático-vagal. O protocolo de indução foi aplicado até três vezes em cada local de estimulação. Definiu-se FA como um ritmo auricular rápido desordenado, com ciclo, polaridade, configuração e amplitude variáveis e duração superior a cinco ciclos24. A duração da FA foi avaliada em cada uma das condições experimentais consideradas.

As variáveis contínuas foram expressas sob a forma de média±desvio padrão e as variáveis categóricas em frequências e percentagens. As comparações foram efetuadas pelo teste de ANOVA e teste t de Student para as variáveis contínuas. O teste de Kolmogorov-Smirnov foi utilizado para avaliar a normalidade da distribuição das variáveis contínuas. A análise comparativa dos valores dos PRE e intervalos de condução basais e durante estimulação autonómica foi efetuada com o teste t de Student emparelhado. Para as variáveis categóricas usámos o teste de χ2, com correção de Yates. Considerámos estatisticamente significativos os resultados com valor<0,05. O programa estatístico utilizado foi o GraphPAD (GraphPad Software, Inc., California, EUA).

Os intervalos de condução entre a AD e a AE aumentaram com a estimulação vagal de 20±4ms para 30±10ms (p<0,05) e diminuíram para 16±6ms com a estimulação simpática (p<0,05). A ativação simpático-vagal simultânea também modificou significativamente a condução interauricular (de 21±5ms to 31±11ms, p<0,05). O tempo de condução entre a AD e as VP aumentou durante a estimulação vagal (p<0,05), diminuiu com a estimulação simpática (p<0,01), mas não teve variação significativa com a estimulação simpático-vagal combinada (Tabela 1).

Relativamente aos valores dos PRE obtidos em basal e durante estimulação autonómica (Tabela 1): em basal, a refratariedade era superior no AAE (83±16ms versus 69±16ms no AAD e 59±16ms nas VP, p<0,01). A estimulação vagal e simpático-vagal causou uma redução significativa consistente dos PRE no AAD, AAE e VP, enquanto a estimulação simpática resultou numa redução dos PRE somente no AAE. Durante a ativação autonómica os PRE diminuíram de forma mais marcada no AAE que nos outros locais. No entanto, com a estimulação vagal mantiveram-se as diferenças estatisticamente significativas entre os PRE das VP e do AAE (p<0,05).

A estimulação autonómica influenciou significativamente a indução e a duração da FA (Tabela 1). Com bursts de 50Hz no AAD, AAE e VP induziu-se FA, de forma intermitente, em 41, 35 e 53% dos coelhos, respetivamente. Durante a estimulação vagal, induziu-se FA, de modo reprodutível, em 76, 65 e 76% dos coelhos com pacing de alta-frequência no AAD, AAE e VP, respetivamente (50Hz versus. 50Hz+vago, p<0,05 para o AAD), e a duração de FA aumentou significativamente com pacing no AAD (6,8±2,5s versus 1,8±1,2s, p<0,01) e VP (3.6±1,6s versus 1,7±0,7s, p<0,05). Em 4 animais, a FA foi iniciada com um extraestímulo combinado com estimulação vagal durante a avaliação do PRE no AAD.

A inducibilidade de FA aumentou durante a estimulação simpática (71, 65 e 76%, para o AAD, AAE e VP, respetivamente), sem atingir significado estatístico. Em dois animais induziram-se curtos períodos de FA com um extraestímulo nos diferentes locais de estimulação, e noutros dois ocorreram despolarizações prematuras espontâneas com origem nas VP. A duração da FA aumentou significativamente somente com estimulação nas VP (9,6±3,7s versus 1,7±0,7s, p<0,05). Durante estimulação combinada simpático-vagal, a FA tornou-se induzível de modo reprodutível com pacing de alta-frequência no AAD, AAE e VP em 88, 100 e 75% dos animais, respetivamente (50Hz versus. 50Hz+simpático e vago, p<0,05 para o AAD e AAE), e a duração da FA aumentou em todos os locais de estimulação. A FA teve duração >10s em 37,5% dos coelhos (somente com estimulação vagal ou simpático-vagal), interrompendo-se imediatamente após suspensão da estimulação vagal em 2/3 dos casos.

Nos últimos anos, a experimentação envolvendo modelos animais tem procurado obter informação relativa aos mecanismos básicos subjacentes à fisiopatologia da FA, resultando num importante contributo para a compreensão de hipóteses eletrofisiológicas como a presença simultânea de múltiplas ondas de despolarização com orientação espacial variável, a atividade focal rápida, os rotores com condução fibrilhatória ou mesmo na identificação de zonas de atividade auricular elétrica fragmentada. No entanto, o desenvolvimento de modelos in vivo com inervação autonómica preservada, que permitam uma avaliação eletrofisiológica dinâmica na presença de diferentes condições da atividade do SNA e sua relação com a génese e manutenção da FA permanece um desafio na investigação atual.

Em cães, os circuitos de micro-reentrada, o automatismo e a atividade trigger têm sido apontados como mecanismos associados a ocorrência de arritmias auriculares28,29. Hayashi e colaboradores usaram estimulação vagal cervical para indução de FA com bursts de pacing auricular em cães anestesiados30. Em trabalhos recentes a estimulação vagal tem sido associada a encurtamento dos PRE auriculares e facilitação da indução de FA em cães17,31. Sabe-se que estes efeitos vagais e a inducibilidade de FA podem ser modificados após ablação epicárdica de plexos ganglionares12,15. Também em doentes submetidos a ablação de FA por cateter, o número de recorrências de FA é diminuído quando o procedimento inclui desinervação vagal seletiva32,33. Neste contexto, o conceito de que a desinervação cardíaca possa desempenhar um papel na prevenção da FA representa uma temática complexa e motivadora que necessita ser clarificada.

Em estudos prévios, a estimulação simpática foi menos eficaz do que a estimulação vagal na influência da refratariedade auricular e indução de FA11,34. No entanto, no modelo do cão submetido a pacing rápido crónico, a estimulação simpática induziu atividade repetitiva das VP e contribuiu para iniciar FA35. Também a estimulação combinada do simpático e parassimpático pode influenciar as propriedades eletrofisiológicas e aumentar a propensão para FA em cães16,35. Os efeitos eletrofisiológicos da atividade autonómica reflexa nas aurículas e VP podem assim ter um papel importante na fisiopatologia da FA.

Permanece por esclarecer qual a sequência de mecanismos responsáveis pela interrupção espontânea da FA. Poderia sugerir-se que a resolução (ou «inversão») das alterações autonómicas que acompanham o início da FA contribuem para terminar a arritmia. Tomita et al., demonstraram que as flutuações da atividade do SNA que precedem o início de episódios de FA retornam a valores normais imediatamente após terminar a FA8. No presente trabalho, utilizando o modelo intacto do coração do coelho, que tem baixa propensão para FA em condições basais, confirmámos a importância dos efeitos potenciais da interação simpático-vagal nas alterações da condução e refratariedade das aurículas e VP e sua contribuição para a inducibilidade e duração da FA. Além disso, a atividade vagal pareceu influenciar diretamente a interrupção da FA, já que em 2/3 dos animais com FA de maior duração a arritmia terminou imediatamente após cessação da estimulação vagal.

A evidência do papel do SNA na génese da FA paroxística tem sido suportada em trabalhos clínicos e em modelos experimentais. Apesar de resultados controversos na análise da variabilidade da frequência cardíaca no período que precede o início espontâneo de FA, os episódios paroxísticos recorrentes parecem estar relacionados com flutuações dinâmicas do tónus autonómico, possivelmente dependendo do sinergismo entre o influxo adrenérgico e a modulação da atividade vagal5,18,36,37. São necessários estudos futuros para elucidar o impacto da inervação e da interação da atividade reflexa simpático-vagal na dinâmica complexa do substrato funcional da arritmogénese auricular.

Uma das limitações diz respeito à avaliação da refratariedade baseada em três locais (AAD, AAE e VP). Na realidade, o procedimento minucioso e demorado de cálculo dos PRE em condições basais e em diferentes condições de estimulação autonómica tornar-se-ia impraticável, nomeadamente no que respeita à manutenção da estabilidade da preparação in vivo. Além disso, a técnica de estimulação elétrica programada com um extraestimulo tem sido amplamente utilizada para o estudo da refratariedade. Estudos futuros poderão justificar o recurso a métodos diferentes para confirmar os atuais resultados. No entanto, no presente trabalho as alterações eletrofisiológicas documentadas, bem como o impacto na indução de FA, ocorreram imediatamente após estimulação autonómica, sugerindo uma clara relação entre os efeitos evocados pela modulação vagal e simpática e os resultados obtidos.

Finalmente, apesar de a indução de FA refletir vulnerabilidade para a arritmia, a dificuldade na sua manutenção, devido à pequena superfície auricular do coração do coelho, torna difícil o estudo dos mecanismos eletrofisiológicos subjacentes à perpetuação da FA.